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本制品包含miRNA检测定量扩增试剂，适用于miRNA、TotalRNA和smallRNAs等包含miRNA样品的定量扩增检测。以miRNA等样品为模板，使用2×miRNASYBRqPCRSuperMix进行扩增检测。

2×miRNA SYBR qPCR SuperMix采用SYBR Green I嵌合荧光法对miRNA进行荧光定量检测。试剂中预混了热启动DNA聚合酶、精心优化的反应Buffer、dNTPs、SYBRGreen I等，进行实验时，PCR反应液的配制十分简单方便。本制品提供两种ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，适用于不同型号的荧光定量PCR仪。另外试剂盒中提供Universal miRNA primer R检测引物，只需设计对应miRNA的上游引物即可，也可以根据说明书中提供的miRNA特异性引物设计原则来设计引物。

• 所有试剂使用前请上下颠倒混匀，尽量避免产生泡沫，并短暂离心后使用。
  
• 使用过程中应确保所用试剂中无RNase污染。
  
• 避免反复冻融。
  
• 反应液配制和添加应在冰上操作。
  
• 为保证逆转录反应的有效进行，需使用较高质量的RNA模板。

• 用ROXI校准的RealTimePCR仪有：
  ABI:5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast/StepOne/StepOnePlus及其他仪器；
  
• 用ROXII校准的RealTimePCR仪有：
  ABI 7500/7500 Fast/ViiA7/QuantStudio 3,5,6 Flex,7 Flex12k Flex；Stratagene:MX4000/MX3500P/MX3000P及其他仪器。
  
• 不需要用ROX校准的RealTimePCR仪有：
  Bio-Rad:CFX96/CFX 384/iCycler iQ/iQ5/MyiQ/MiniOpticon/Opticon/Opticon2/Chromo4；
  Eppendorf:MasterCycler ep realplex/realplex 2s；
  Cepheid:SmartCycler；
  Illumina:Eco qPCR；
  Roche Applied Science:LightCycler480/LightCycler2.0/Lightcycler96；
  Thermo Scientific:PikoReal Cycler；
  Qiagen:Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/Rotor-Gene 6000及其他仪器。

• 常用反应体系：
  

  成分	用量
  2×miRNA SYBR qPCR SuperMix	10μL
  上游引物（10μM）	0.4μL
  下游引物（10μM）	0.4μL
  cDNA模板	Xμl
  ROX	0.4μL
  RNase-Free H2O至	20μL

• 常用PCR程序：
  

  ➤两步法：	➤三步法：
  温度 时间 循环数 95℃ 1min 1 95℃ 5s 40～45 60℃ 30s	温度 时间 循环数 95℃ 1min 1 95℃ 5s 40～45 60℃ 20s 72℃ 30s

• 该试剂盒提供Universal miRNA primer R，只需设计对应miRNA的上游引物即可。试剂盒中Universal miRNA primer R的Tm值为63℃，设计miRNA Primer F的Tm值也尽量在60～65℃范围之内。
  
• 为了提高引物间特异性，也可以根据目的miRNA设计特异性上、下游引物进行检测（设计原则见下方）。
  
• 引物设计完毕后，经过miRbase进行进一步验证（blast），以确定特异性。

• 对于正向引物：
  
  • 选择最长的正向引物（12～18个碱基长），需要在miRNA的3’末端留下4～8个碱基用于设计反向引物；
    
  • 设计正向引物，其3'末端的最后5个碱基中应包括2-3个A/T残基，最后的2个碱基中应包括1个A/T残基；
    
  • 当正向引物的Tm值低于60℃，需要在5’末端依次添加以下碱基：GACGC，需要单个碱基依次添加，查看Tm值的变化，直到Tm在60℃以上为止。
    例如添加三个碱基时，引物序列为：CAGN_12~18，其中N₁₈是18个miRNA特异性碱基，CAG是添加碱基；最长的引物则是：CGCAGN_12~18，其中N₁₈是18个miRNA特异性碱基，CGCAG是与miRNA不互补的5'末端序列；
    
  • 如果正向引物的Tm值较高（＞65℃），则一般需要从5’端移除碱基，直到Tm值小于65℃，大于60℃。
• 对于反向引物：
  
  • 根据正向引物设计原则步骤b选择最佳3’末端的反向引物。
    
  • 在反向引物的5’末端加入15个T碱基。
    
  • 反向引物的Tm值低于60℃时，需要在5’末端依次添加以下碱基：GACCTGGAC，需要单个依次碱基添加，查看Tm值的变化，直到Tm在60℃以上为止。
    例如添加三个碱基时，引物序列为：CAGT₁₅N_4~8，其中，N_4~8是8个miRNA特异性碱基，T₁₅是15个T碱基，CAG是添加碱基。最长的引物则是：CAGGTCCAGT₁₅N_4~8，其中，N_4~8是8个miRNA特异性碱基，T₁₅是15个T碱基，CAGGTCCAG是与miRNA不互补的5'末端序列。
• 实例：hsa-miR-21（序列：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUG）
  正向引物：5'-GCAGTAGCTTATCAGACTGAT-3'
  反向引物：5'-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCAAC-3'